Il passo successivo è stato esaminare come il complesso CRISPR interagiva con loro, utilizzando il software di ripiegamento delle proteine basato sull’intelligenza artificiale AlphaFold. Le versioni riviste sono progettate per gestire le interazioni tra proteine e acidi nucleici, nonché complessi multiproteici. Quindi il team ha alimentato le versioni AlphaFold della sequenza di DNA target, insieme all’RNA guida, alla sequenza Cas9 e a un enzima che modifica chimicamente le basi e può legarsi a Cas9.
Purtroppo lo ha soffocato, mettendo una delle proteine nel posto evidentemente sbagliato.
Imperterrito, il team ha semplificato le cose e ha alimentato AlphaFold solo con DNA, RNA e proteina Cas9, poiché quest’ultima è il fattore principale che determina la specificità della sua sequenza. Ciò ha funzionato molto meglio, producendo una struttura che corrispondeva a quelle determinate da esperimenti con acidi nucleici e proteine reali.
Confrontando le strutture prodotte da AlphaFold quando vengono dati diversi siti dentro e fuori bersaglio, i ricercatori hanno trovato uno schema comune. La maggior parte (circa due terzi) dei siti fuori bersaglio ha fatto sì che la proteina Cas9 adottasse una struttura leggermente diversa. Ma quasi tutti (più del 95%) cambiano quali aminoacidi influenzano l’RNA. Quindi ci sono chiaramente alcuni casi in cui Cas9 mantiene la sua struttura normale ma gli amminoacidi al suo interno sono mutati in modo da consentire la formazione di basi sbagliate per siti fuori bersaglio.
In poche parole, AlphaFold era già stato creato per identificare la cosiddetta “probabilità di contatto”, cioè la possibilità che due elementi qualsiasi, come amminoacidi o nucleotidi, si trovino a una distanza molto piccola (otto Angstrom). I ricercatori possono prendere il risultato dell’analisi della probabilità di contatto sui siti interni ed esterni del bersaglio e confrontarli, identificando esattamente quali aminoacidi in Cas9 cambiano contatti se c’è una mancata corrispondenza tra l’RNA guida e il DNA. Hanno chiamato questa configurazione di analisi del computer “ContactSeek”.
Migliore targeting
Di per sé, ContactSeek tende a generare un ampio elenco di aminoacidi che mutano quando si legano a un sito non bersaglio. Quindi i ricercatori si sono concentrati sulle regioni della proteina Cas9 in cui questi amminoacidi sono combinati, vedendo questo come un segno che queste aree si stavano adattando alle variazioni causate da basi non corrispondenti. Hanno quindi iniziato a testare versioni di Cas9 con diversi aminoacidi in questi siti.